Javascript в настоящее время отключен в вашем браузере.Когда javascript отключен, некоторые функции этого сайта не будут работать.
Хавьер Фидальго, * Пьер-Антуан Деглесн, * Родриго Арройо, * Лилиан Сепульведа, * Евгения Раннева, Филипп Депре, научный отдел, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Каталония, Испания Предыстория вклада: Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой встречающийся в природе полисахарид, используемый в производстве кожных наполнителей для эстетических целей.Поскольку период полураспада в тканях человека составляет несколько дней, дермальные наполнители на основе ГК химически модифицируют, чтобы продлить их жизнь в организме.Наиболее распространенной модификацией коммерческих наполнителей на основе ГК является использование 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) в качестве сшивающего агента для сшивания цепей ГК.Остаточный или непрореагировавший BDDE считается нетоксичным при концентрации <2 частей на миллион (ppm);поэтому остаточный BDDE в конечном кожном наполнителе должен быть определен количественно, чтобы обеспечить безопасность пациента.Материалы и методы. В этом исследовании описывается обнаружение и характеристика побочного продукта реакции сшивки между BDDE и ГК в щелочных условиях путем сочетания жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС).Результаты: После различных анализов было обнаружено, что щелочные условия и высокая температура, используемые для дезинфекции гидрогеля HA-BDDE, способствуют образованию этого нового побочного продукта, «подобного пропиленгликолю» соединения.Анализ ЖХ-МС подтвердил, что побочный продукт имеет ту же моноизотопную массу, что и BDDE, другое время удерживания (tR) и другой режим УФ-поглощения (λ=200 нм).В отличие от BDDE при анализе ЖХ-МС было обнаружено, что при тех же условиях измерения этот побочный продукт имеет более высокую скорость обнаружения при 200 нм.Вывод: Эти результаты показывают, что в структуре этого нового соединения нет эпоксида.Обсуждение открыто для оценки риска этого нового побочного продукта, обнаруженного при производстве гидрогеля HA-BDDE (кожный наполнитель HA) для коммерческих целей.Ключевые слова: гиалуроновая кислота, дермальный филлер на основе ГК, сшитая гиалуроновая кислота, BDDE, ЖХ-МС анализ, побочный продукт BDDE.
Филлеры на основе гиалуроновой кислоты (ГК) являются наиболее распространенными и популярными дермальными наполнителями, используемыми в косметических целях.1 Этот дермальный наполнитель представляет собой гидрогель, обычно состоящий из >95% воды и 0,5-3% ГК, что придает им гелеобразную структуру.2 ГК является полисахаридом и основным компонентом внеклеточного матрикса позвоночных.Один из ингредиентов.Он состоит из повторяющихся дисахаридных звеньев (1,4)-глюкуроновой кислоты-β (1,3)-N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), соединенных гликозидными связями.Этот дисахаридный паттерн одинаков во всех организмах.По сравнению с некоторыми наполнителями на белковой основе (например, коллагеном) это свойство делает ГК высоко биосовместимой молекулой.Эти наполнители могут проявлять специфичность аминокислотной последовательности, которая может быть распознана иммунной системой пациента.
При использовании в качестве дермального наполнителя основным ограничением ГК является ее быстрый оборот в тканях из-за присутствия определенного семейства ферментов, называемых гиалуронидазами.К настоящему времени описано несколько химических модификаций в структуре ГК для увеличения времени полужизни ГК в тканях.3 Большинство этих модификаций пытаются уменьшить доступ гиалуронидазы к полисахаридным полимерам путем сшивания цепей ГК.Следовательно, из-за образования мостиков и межмолекулярных ковалентных связей между структурой ГК и сшивающим агентом сшитый гидрогель ГК производит больше продуктов антиферментативной деградации, чем природная ГК.4-6
До сих пор химические сшивающие агенты, используемые для получения сшитой ГК, включали метакриламид, 7-гидразид, 8-карбодиимид, 9-дивинилсульфон, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE) и поли(этиленгликоль)диглицидиловый эфир.10,11 В настоящее время BDDE является наиболее часто используемым сшивающим агентом.Хотя безопасность этих типов гидрогелей доказана десятилетиями, используемые сшивающие агенты представляют собой реактивные реагенты, которые могут быть цитотоксическими и, в некоторых случаях, мутагенными.12 Поэтому их остаточное содержание в конечном гидрогеле должно быть высоким.BDDE считается безопасным, когда остаточная концентрация составляет менее 2 частей на миллион (ppm).4
Существует несколько методов определения концентрации BDDE с низким содержанием остатков, степени сшивания и положения замещения в гидрогелях ГК, таких как газовая хроматография, эксклюзионная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (МС), методы измерения флуоресценции методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с диодной матрицей.13-17 В этом исследовании описывается обнаружение и характеристика побочного продукта в конечном гидрогеле поперечно-сшитой ГК, полученном реакцией BDDE и ГК в щелочных условиях.ВЭЖХ и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС анализ).Поскольку токсичность этого побочного продукта BDDE неизвестна, мы рекомендуем проводить количественную оценку его остатка способом, аналогичным методу, который обычно применяется для BDDE в конечном продукте.
Полученная натриевая соль ГК (Shiseido Co., Ltd., Токио, Япония) имеет молекулярную массу ~1368000 Да (метод Лорана) 18 и характеристическую вязкость 2,20 м3/кг.Для реакции сшивания BDDE (≥95%) был приобретен у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США).Фосфатно-солевой буфер с рН 7,4 был приобретен у компании Sigma-Aldrich.Все растворители, ацетонитрил и вода, использованные в анализе ЖХ-МС, были приобретены у компании, имеющей качество для ВЭЖХ.Муравьиная кислота (98%) приобретается марки ХЧ.
Все эксперименты были выполнены на системе UPLC Acquity (Waters, Милфорд, Массачусетс, США) и подключены к тройному квадрупольному масс-спектрометру API 3000, оснащенному источником ионизации электрораспылением (AB SCIEX, Фрамингем, Массачусетс, США).
Синтез гидрогелей поперечно-сшитой ГК начинали добавлением 198 мг BDDE к 10% (масс./масс.) раствору гиалуроната натрия (NaHA) в присутствии 1% щелочи (гидроксид натрия, NaOH).Конечная концентрация BDDE в реакционной смеси составила 9,9 мг/мл (0,049 мМ).Затем реакционную смесь тщательно перемешивали и гомогенизировали и оставляли на 4 часа при 45°С.19 pH реакции поддерживается на уровне ~12.
После этого реакционную смесь промывали водой, а конечный гидрогель HA-BDDE фильтровали и разбавляли буфером PBS до достижения концентрации HA от 10 до 25 мг/мл и конечного pH 7,4.Для стерилизации полученных гидрогелей поперечно-сшитой ГК все эти гидрогели автоклавируют (120°С в течение 20 минут).Очищенный гидрогель BDDE-HA хранят при 4°C до проведения анализа.
Для анализа BDDE, присутствующего в продукте поперечно-сшитой ГК, образец массой 240 мг взвешивали и помещали в центральное отверстие (Microcon®; Merck Millipore, Биллерика, Массачусетс, США; объем 0,5 мл) и центрифугировали при 10 000 об/мин при комнатной температуре. 10 минут.Всего было собрано и проанализировано 20 мкл вытягиваемой жидкости.
Для анализа стандарта BDDE (Sigma-Aldrich Co) в щелочных условиях (1 %, 0,1 % и 0,01 % NaOH), если выполняются следующие условия, жидкий образец имеет соотношение 1:10, 1:100 или до 1:1 000 000 При необходимости используйте для анализа деионизированную воду MilliQ.
Для исходных материалов, используемых в реакции сшивания (2% HA, H2O, 1% NaOH и 0,049 мМ BDDE), 1 мл каждого образца, приготовленного из этих материалов, анализировали с использованием тех же условий анализа.
Для определения специфичности пиков, появляющихся на карте ионов, к пробе объемом 20 мкл добавляли 10 мкл стандартного раствора BDDE с концентрацией 100 частей на миллиард (Sigma-Aldrich Co).В этом случае конечная концентрация стандарта в каждом образце составляет 37 частей на миллиард.
Сначала приготовьте исходный раствор BDDE с концентрацией 11 000 мг/л (11 000 частей на миллион), разбавив 10 мкл стандартного BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 мкл воды MilliQ (плотность 1,1 г/мл).Используйте этот раствор для приготовления раствора BDDE с концентрацией 110 мкг/л (110 частей на миллиард) в качестве промежуточного стандартного разведения.Затем используйте промежуточный стандартный разбавитель BDDE (110 частей на миллиард), чтобы построить стандартную кривую, несколько раз разбавляя промежуточный разбавитель для достижения желаемой концентрации 75, 50, 25, 10 и 1 частей на миллиард.Как показано на рисунке 1, обнаружено, что стандартная кривая BDDE от 1,1 до 110 частей на миллиард имеет хорошую линейность (R2>0,99).Стандартная кривая повторялась в четырех независимых экспериментах.
Рисунок 1 Стандартная калибровочная кривая BDDE, полученная с помощью анализа ЖХ-МС, в которой наблюдается хорошая корреляция (R2>0,99).
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия.
Для идентификации и количественной оценки стандартов BDDE, присутствующих в сшитой ГК, и стандартов BDDE в базовом растворе использовали анализ ЖХ-МС.
Хроматографическое разделение осуществляли на колонке LUNA 2,5 мкм C18(2)-HST (50×2,0 мм2; Phenomenex, Торранс, Калифорния, США) и выдерживали при комнатной температуре (25°C) во время анализа.Подвижная фаза состоит из ацетонитрила (растворитель А) и воды (растворитель Б), содержащей 0,1% муравьиной кислоты.Подвижную фазу элюируют градиентным элюированием.Градиент следующий: 0 минут, 2% А;1 минута, 2% А;6 минут, 98% А;7 минут, 98% А;7,1 мин, 2% А;10 минут, 2% А. Время работы 10 минут, объем инъекции 20 мкл.Время удерживания BDDE составляет около 3,48 минут (от 3,43 до 4,14 минут на основе экспериментов).Подвижную фазу прокачивали со скоростью потока 0,25 мл/мин для анализа ЖХ-МС.
Для анализа BDDE и количественного определения с помощью МС систему UPLC (Waters) комбинируют с тройным квадрупольным масс-спектрометром API 3000 (AB SCIEX), оснащенным источником ионизации электрораспылением, и анализ проводят в режиме положительных ионов (ESI+).
Согласно анализу ионного фрагмента, выполненному на BDDE, фрагмент с наибольшей интенсивностью был определен как фрагмент, соответствующий 129,1 Да (рис. 6).Следовательно, в режиме многоионного мониторинга (MIM) для количественного определения преобразование массы (отношение массы к заряду [m/z]) BDDE составляет 203,3/129,1 Да.Он также использует режим полного сканирования (FS) и режим сканирования ионов продукта (PIS) для анализа ЖХ-МС.
Для проверки специфичности метода анализировали холостую пробу (исходную подвижную фазу).В холостом образце с конверсией массы 203,3/129,1 Да сигнала не обнаружено.Что касается повторяемости эксперимента, были проанализированы 10 стандартных вводов 55 частей на миллиард (в середине калибровочной кривой), что привело к остаточному стандартному отклонению (RSD) <5% (данные не показаны).
Остаточное содержание BDDE было количественно определено в восьми различных автоклавированных гидрогелях BDDE с поперечно-сшитой ГК, соответствующих четырем независимым экспериментам.Как описано в разделе «Материалы и методы», количественную оценку оценивают по среднему значению кривой регрессии стандартного разведения БДДЭ, которое соответствует уникальному пику, обнаруженному при переходе массы БДДЭ 203,3/129,1 Да, с удерживанием время от 3,43 до 4,14 мин. Не дожидаясь.На рисунке 2 показан пример хроматограммы эталонного стандарта BDDE с концентрацией 10 частей на миллиард.В таблице 1 приведены данные об остаточном содержании BDDE в восьми различных гидрогелях.Диапазон значений составляет от 1 до 2,46 частей на миллиард.Следовательно, остаточная концентрация BDDE в образце приемлема для человека (<2 частей на миллион).
Рисунок 2. Ионная хроматограмма эталонного стандарта BDDE 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), переход МС (m/z), полученный с помощью анализа ЖХ-МС 203,30/129,10 Да (в положительном режиме MRM).
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций;МС, масса;m/z, отношение массы к заряду.
Примечание. Образцы 1–8 представляют собой автоклавированные гидрогели с поперечно-сшитой ГК BDDE.Также сообщается об остаточном количестве BDDE в гидрогеле и максимальном времени удерживания BDDE.Наконец, также сообщается о существовании новых пиков с разным временем удерживания.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ГК, гиалуроновая кислота;MRM, мониторинг множественных реакций;tR, время удерживания;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;RRT, относительное время удерживания.
Неожиданно анализ ионной хроматограммы ЖХ-МС показал, что на основе всех проанализированных образцов гидрогеля с поперечно-сшитой ГК, подвергнутых автоклавной обработке, наблюдался дополнительный пик при более коротком времени удерживания от 2,73 до 3,29 минут.Например, на рис. 3 показана ионная хроматограмма образца поперечно-сшитой ГК, где появляется дополнительный пик при другом времени удерживания, равном приблизительно 2,71 минуты.Было обнаружено, что наблюдаемое относительное время удерживания (RRT) между вновь наблюдаемым пиком и пиком от BDDE составляет 0,79 (таблица 1).Поскольку мы знаем, что вновь наблюдаемый пик меньше сохраняется на колонке C18, используемой в анализе ЖХ-МС, новый пик может соответствовать более полярному соединению, чем BDDE.
Рисунок 3. Ионная хроматограмма образца гидрогеля поперечно-сшитой ГК, полученного с помощью ЖХ-МС (преобразование массы MRM 203,3/129,0 Да).
Сокращения: ГК, гиалуроновая кислота;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций;RRT, относительное время удерживания;tR, время удерживания.
Чтобы исключить возможность того, что новые наблюдаемые пики могут быть загрязнителями, изначально присутствующими в используемом сырье, это сырье также было проанализировано с использованием того же метода анализа ЖХ-МС.Анализируемые исходные материалы включают воду, 2% NaHA в воде, 1% NaOH в воде и BDDE в той же концентрации, что и в реакции сшивания.Ионная хроматограмма используемого исходного материала не показала никакого соединения или пика, и ее время удерживания соответствует новому наблюдаемому пику.Этот факт отбрасывает представление о том, что не только исходный материал может содержать какие-либо соединения или вещества, которые могут мешать процедуре анализа, но и отсутствуют признаки возможного перекрестного загрязнения другими лабораторными продуктами.Значения концентрации, полученные после анализа BDDE методом ЖХ-МС, и новые пики показаны в таблице 2 (образцы 1-4), а ионная хроматограмма — на рисунке 4.
Примечание. Образцы 1–4 соответствуют сырью, используемому для производства автоклавированных гидрогелей BDDE с поперечно-сшитой ГК.Эти образцы не подвергались автоклавированию.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ГК, гиалуроновая кислота;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций.
Рисунок 4 соответствует хроматограмме ЖХ-МС образца сырья, использованного в реакции сшивки ГК и БДДЭ.
Примечание. Все они измеряются при той же концентрации и соотношении, которые использовались для проведения реакции сшивания.Номера анализируемого сырья на хроматограмме соответствуют: 1 – вода, 2 – 2 % водный раствор ГК, 3 – 1 % водный раствор NaOH.Анализ ЖХ-МС выполняется для преобразования массы 203,30/129,10 Да (в положительном режиме MRM).
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ГК, гиалуроновая кислота;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций.
Исследованы условия, приведшие к образованию новых пиков.Чтобы изучить, как условия реакции, используемые для получения поперечно-сшитого гидрогеля ГК, влияют на реакционную способность сшивающего агента BDDE, приводя к образованию новых пиков (возможных побочных продуктов), были выполнены различные измерения.В этих определениях мы изучили и проанализировали конечный сшивающий агент BDDE, который был обработан различными концентрациями NaOH (0%, 1%, 0,1% и 0,01%) в водной среде с последующим автоклавированием или без него.Процедура с бактериями для имитации тех же условий такая же, как и метод, используемый для получения гидрогеля поперечно-сшитой ГК.Как описано в разделе «Материалы и методы», переход массы образца был проанализирован с помощью ЖХ-МС до 203,30/129,10 Да.Рассчитывают BDDE и концентрацию нового пика, результаты представлены в табл. 3. В образцах, не подвергавшихся автоклавированию, новых пиков обнаружено не было, независимо от присутствия в растворе NaOH (образцы 1-4, табл. 3).Для автоклавированных образцов новые пики обнаруживаются только в присутствии NaOH в растворе, а формирование пика, по-видимому, зависит от концентрации NaOH в растворе (образцы 5-8, таблица 3) (RRT = 0,79).На рис. 5 показан пример ионной хроматограммы двух автоклавированных образцов в присутствии или в отсутствие NAOH.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций.
Примечание: верхняя хроматограмма: образец обрабатывали 0,1% водным раствором NaOH и автоклавировали (120°C, 20 минут).Нижняя хроматограмма: образец не обрабатывали NaOH, а автоклавировали в тех же условиях.Преобразование массы 203,30/129,10 Да (в положительном режиме MRM) анализировали с помощью ЖХ-МС.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций.
Во всех автоклавированных образцах с NaOH или без него концентрация BDDE была значительно снижена (до 16,6 раз) (образцы 5-8, табл. 2).Снижение концентрации BDDE может быть связано с тем, что при высоких температурах вода может действовать как основание (нуклеофил), открывая эпоксидное кольцо BDDE с образованием соединения 1,2-диола.Моноизотопное качество этого соединения отличается от качества BDDE и, следовательно, не будет затронуто.ЖХ-МС обнаружила массовый сдвиг 203,30/129,10 Да.
Наконец, эти эксперименты показывают, что генерация новых пиков зависит от присутствия BDDE, NAOH и процесса автоклавирования, но не имеет ничего общего с ГК.
Новый пик, обнаруженный при времени удерживания приблизительно 2,71 минуты, был затем охарактеризован методом ЖХ-МС.Для этого БДДЭ (9,9 мг/мл) инкубировали в 1% водном растворе NaOH и автоклавировали.В таблице 4 характеристики нового пика сравниваются с известным эталонным пиком BDDE (время удерживания приблизительно 3,47 минуты).На основании анализа ионной фрагментации двух пиков можно сделать вывод, что пик со временем удерживания 2,72 минуты показывает те же фрагменты, что и пик BDDE, но с другой интенсивностью (рис. 6).Для пика, соответствующего времени удерживания (PIS) 2,72 мин, более интенсивный пик наблюдался после фрагментации при массе 147 Да.При концентрации BDDE (9,9 мг/мл), использованной в данном определении, после хроматографического разделения также наблюдались различные режимы поглощения (УФ, λ=200 нм) в ультрафиолетовом спектре (рис. 7).Пик со временем удерживания 2,71 мин все еще виден при 200 нм, тогда как пик BDDE не наблюдается на хроматограмме в тех же условиях.
Таблица 4. Результаты характеристики нового пика со временем удерживания около 2,71 минуты и пика BDDE со временем удерживания 3,47 минуты
Примечание. Для получения этих результатов для двух пиков были выполнены анализы ЖХ-МС и ВЭЖХ (MRM и PIS).Для ВЭЖХ-анализа используется УФ-детектирование с длиной волны 200 нм.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций;m/z, отношение массы к заряду;PIS, ионное сканирование продукта;ультрафиолетовый свет, ультрафиолетовый свет.
Примечание. Фрагменты массы получают с помощью анализа ЖХ-МС (PIS).Верхняя хроматограмма: масс-спектр фрагментов стандартного образца BDDE.Нижняя хроматограмма: Масс-спектр нового обнаруженного пика (RRT, связанный с пиком BDDE, составляет 0,79).BDDE обрабатывали 1% раствором NaOH и автоклавировали.
Сокращения: BDDE, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола;ЖХ-МС, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия;MRM, мониторинг множественных реакций;PIS, сканирование ионов продукта;RRT, относительное время удерживания.
Рис. 7. Ионная хроматограмма иона-предшественника массой 203,30 Да и (А) новый пик со временем удерживания 2,71 минуты и (В) пик УФ-детектирования эталонного стандарта BDDE при 3,46 минуты при 200 нм.
Во всех полученных гидрогелях поперечно-сшитой ГК было обнаружено, что остаточная концентрация BDDE после количественного определения ЖХ-МС составляла <2 частей на миллион, но в анализе появился новый неизвестный пик.Этот новый пик не соответствует стандартному продукту BDDE.Стандартный продукт BDDE также подвергся такому же анализу преобразования качества (преобразование MRM 203,30/129,10 Да) в положительном режиме MRM.Как правило, другие аналитические методы, такие как хроматография, используются в качестве предельных тестов для обнаружения BDDE в гидрогелях, но максимальный предел обнаружения (LOD) немного ниже 2 частей на миллион.С другой стороны, до сих пор ЯМР и МС использовали для характеристики степени сшивания и/или модификации ГК во фрагментах сахарных единиц поперечно-сшитых продуктов ГК.Цель этих методов никогда не заключалась в количественном определении обнаружения остаточного BDDE при таких низких концентрациях, как мы описываем в этой статье (LOD нашего метода ЖХ-МС = 10 частей на миллиард).
Время публикации: 01 сентября 2021 г.